HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie)
použití: separace látek rozpuštěných v roztoku, tj. používá se kapalný vzorek nepříliš těkavých látek (rozdíl od GC)
(stanovení organických kyselin, polyaromatických uhlovodíků, bílkovin, sacharidů, vitamínů, léčiv, různých metabolitů)
uspořádání: mobilní fáze prochází pod tlakem (pumpa) náplňovou kolonou, která je naplněna stacionární fází (ocelová trubice dlouhá 5-35 cm, o vnitřním průměru 3 - 5 mm, vyplněná malými pevnými částicemi, které mají podle druhu kolony určité funkční skupiny)
a) chromatografie s “normálními” fázemi
stacionární fáze: polární (polární funkční skupiny, např. - CN, - NH2 , - N(CH3)2 )
mobilní fáze: nepolární (chloroform, methylenchlorid, hexan, heptan)
b) chromatografie s reverzními fázemi (RP HPLC) tj. s obrácenými fázemi než bylo původní uspořádání (často používané uspořádání HPLC)
stacionární fáze: nepolární (tj. nepolární funkční sk.)
mobilní fáze: polární (methanol, H2O, acetonitril aj.)
detekce: detektor je připojen k výstupu z kolony, v různém čase jím prochází mobilní fáze s jednotlivými složkami dělené směsi
příklady detektorů:
* spektrofotometrický (UV-VIS) - měří se absorbance - stanovované koncentrace: až 10-7 g/l
* fluorescenční - měří se intenzita fluorescence - stanovované koncentrace: až 10-9 g/l
Záznam z detektoru se nazývá chromatogram = graf, který znázorňuje odezvu detektoru během celé analýzy (např. je měřena absorbance mobilní fáze, která s sebou unáší jednotlivé složky dělené směsi, v čase od nástřiku vzorku do kolony až do ukončení analýzy). Výsledky jsou zpracovány pomocí PC.
nástřik - způsob zavedení analyzovaného vzorku do chromatografického systému
pík (eluční křivka, eluční vlna) - část chromatogramu, zaznamenávající odezvu detektoru na složku nebo skupinu nerozdělených složek směsi
eluční (retenční) čas - tR (min) - čas od nástřiku vzorku k maximu eluční křivky dané složky
mrtvý eluční (retenční) čas - tM (min) - eluční čas složky, která není v koloně zadržována, prochází kolonou stejně rychle jako mobilní fáze, vychází z kolony jako prvá
mrtvý objem kolony - VM (ml) - je přibližně roven celkovému objemu mobilní fáze v koloně
citlivost detekce - změna odezvy detektoru, odpovídající jednotkové změně koncentrace detegované látky
mez detekce - nejmenší koncentrace analyzované látky, jež lze zjistit z chromatogramu
kvalitativní hodnocení = identifikace složek ve vzorku - stejné látky mají za stejných podmínek dělení shodné retenční časy: porovnáním s retenčními časy standardních roztoků lze určit kvalitativní složení vzorku - podmínkou je dokonalé oddělení eluční vlny látky (píku) od ostatních píků nalezených v chromatogramu
Pro dosažení vhodného oddělení stanovované látky (složky vzorku) lze upravit podmínky analýzy:
* výběr vhodné kolony (velikost, náplň)
* výběr vhodné mobilní fáze
* nastavení optimální rychlosti toku mobilní fáze kolonou
kvantitativní hodnocení = množství složky ve vzorku - sestrojení kalibrační křivky ze známých koncentrací standardů téže látky jako závislost výšky nebo plochy píku na koncentraci
- zjištění výšky nebo plochy píku stanovované látky a odečtení odpovídající koncentrace z kalibrační křivky