Buněčný cyklus (mitóza)
Prokaryotická buňka se dělí velmi rychle a jednoduše (obsahuje jediný chromozom), buněčné dělení u eukaryotické buňky je mnohem složitější - její jaderný genom je tvořen mnoha chromozomy, malá část jejího genomu je mimojaderná. Eukaryotické buňky také obsahují mnoho membránových organel a cytoskeletálních filament. Během buněčného cyklu, což je období buňky od jejího vzniku do jejího rozdělení, musí tedy buňka zduplikovat svůj jaderný a cytoplazmatický materiál a rovnoměrně jej rozdělit do dceřiných buněk. Tímto způsobem se dělí somatické buňky- jejich buněčný cyklus je zakončen mitózou a vznikají při něm dceřiné buňky se shodnou genetickou výbavou jakou měla buňka mateřská. Při zrání pohlavních buněk probíhá zvláštní buněčný cyklus, zakončený meiózou, při němž se dceřiné buňky liší genetickou výbavou od buňky mateřské.
Buněčný cyklus somatické eukaryotické buňky se skládá z metabolicky aktivní, dlouhé interfáze a ze závěrečné M-fáze - mitózy, která zahrnuje karyokinezi a cytokinezi.
Interfáze je doba mezi dvěma M-fázemi, kterou dělíme na na G1 fázi, S fázi a G2 fázi.
G1 fáze obsahuje hlavní kontrolní bod buněčného cyklu a má proto ze všech fází nejvíce proměnlivou délku v závislosti na vnějších podmínkách. V této fázi dochází k intenzivní syntéze RNA a proteinů, buňka roste, duplikuje cytoplazmatické organely a syntézou DNA polymerázy, některých enzymů a zásoby nukleotidů se připravuje na následující replikaci jaderné DNA, na syntetickou fázi.
S fáze (syntetická fáze) je obdobím replikace DNA chromozomů, nejdříve jejich euchromatinových, pozěji heterochromatinových úseků. Současně probíhá syntéza histonů, nezbytná pro tvorbu nových chromatinových vláken. Na konci S fáze je každý chromozom tvořen dvěma chromatidami spojenými centromérou a jádro obsahuje dvojnásobné množství DNA, než před jejím zahájením. (Replikace mimojaderné DNA probíhá během celé interfáze).
G2fáze je relativně krátké období, v němž pokračuje růst buňky, syntéza RNA a proteinů, tvorba organel a dalších buněčných struktur. Tato fáze obsahuje kontrolní body pro zahájení karyokineze a cytokineze.
M-fáze, mitóza je zahájena kondenzací chromozomů. Je to plynulý sled událostí, který podle morfologie a umístění chromozomů dělíme na 5stádií.
Profáze je zahájena rozestupem dceřiných centriolů k pólům buňky a tvorbou mitotického vřeténka. Kondenzace chromozomů pokračuje, přechodně se pozastavuje jejich genetická aktivita. Jadérko se postupně zmenšuje.
Prometafáze začíná náhlým rozpadem jaderného obalu a zánikem jadérka. Chromozomy se připojují na mitotické vřeténko, je dokončována jejich kondenzace.
Metafáze vede k postupnému uspořádání chromozomů v ekvatoriální rovině buňky - je to období jejich dynamické stability. Každý chromozom je složen ze dvou chromatid.
Anafáze začíná oddělením dceřiných chromatid každého chromozomu, ze kterých se tak stávají dceřiné chromozomy. Každý z nich je tažen k opačnému pólu dělicího vřeténka.
Během telofáze se obě sady dceřiných chromozomů dostávají k pólům buňky, vytvářejí se jaderné membrány dceřiných jader. Jádra rostou, v místech nukleolárních organizátorů se tvoří jadérka. Chromozomy dekondenzují do svého aktivního interfázového stavu. Je dokončována cytokineze - u živočišných buněk pomocí kontraktilního prstence, u rostlinných buněk tvorbou nové buněčné stěny.
Dvě vzniklé dceřiné buňky jsou opět ve stadiu počínající interfáze.
Analýza buněčného cyklu pomocé průtokové cytometrie
Průtoková cytometrie je technika pro rychlé měření jednotlivých částic nebo buněk, které procházejí snímacím místem. Jednou z nejpodstatnějších vlastností průtokové cytometrie (cytometrické analýzy) je skutečnost, že se provádí měření každé jednotlivé buňky nebo částice a nejde tedy o průměrné hodnoty měřené v suspenzi. Průtokový cytometr je vybaven argonovým laserem, který umožňuje analýzu mnoha buněčných parametrů na základě rozptylu světla nebo fluorescence. Rozptyl světla odpovídá velikosti a granularitě (denzitě) procházejících buněk nebo částic. Například lymfocyty jsou malé a denzní buňky, naopak granulocyty jsou buňky větší s vyšší denzitou (Obr. 1).
Obr. 1.: osa Y – granulace, osa X - velikost
Metodika průtokové cytometrie při barvení buněk s fluorescenčním barvivem, které je konjugováno s monoklonálními protilátkami, umožňuje určit přítomnost, i distribuci cytoplazmatických znaků (při použití metod itracelulárního barvení i intracelulárních znaků). Tyto cytoplazmatické znaky jako tzv. diferenciační znaky (Clusters of Differentiation - CD) umožňují určovat specifické buněčné subpopulace - například CD4+ T lymfocyty značené monoklonální protilátkou proti znaku CD4 na jejich povrchu. Aplikací metod průtokové cytometrie je celá řada. Jednou z velmi hojně používaných aplikací je analýza obsahu DNA (buněčného cyklu). Tato metoda využívá fluorescenční barvu, jež se váže specificky a stechiometricky na DNA a jeíjž fluorescence je zvýšená po navázání na DNA. Měření obsahu NA v jednotlivých buňkách poskytuje statický pohled na buněčný cyklus (Obr. 2).
Obr. 2: osa Y – počet buněk, osa X – obsah DNA (intenzita fluorescence)