Izolace DNA
DNA lze teoreticky izolovat z jakékoliv živočišné tkáně obsahující živé buňky. U organismů malé velikosti se k izolaci používá i celých jedinců. V tomto případě však samozřejmě hrozí kontaminace parazity, symbionty a potravou. U jednobuněčných živočichů se někdy používá postup, při kterém se nejprve daný jedinec (nebo několik jedinců) rozmnoží a DNA je potom izolována ze všech jedinců najednou. U obratlovců, jejichž erytrocyty mají jádro, se dá DNA snadno izolovat z krve. Běžně se tak například izoluje DNA i z malých druhů ptáků. U savců je izolace DNA z krve problematičtější a vyžaduje poměrně velké množství (několik mililitrů) krve. U malých savců nebo obojživelníků sice velmi kvalitní DNA získáme z čerstvé ledviny nebo svaloviny, obvykle však vystačíme například s odstřihnutým koncem ocásku nebo částí prstu, takže zvíře nemusíme usmrtit. Při použití speciálních technik je možné izolovat DNA i z takových zdrojů, jako jsou jednotlivé chlupy nebo trus (viz kap. „Aplikace PCR“). Tyto techniky však jsou poměrně obtížné a citlivé na kontaminaci.
Často lze izolovat DNA i z muzejního materiálu. Dobrým zdrojem DNA jsou hlavně tkáně uchovávané v lihu. Naopak izolace DNA ze vzorků, které přišly do styku s formalínem, často končí neúspěchem. DNA lze občas získat i z velmi starých vzorků (řádově i desítky tisíc let starých). DNA byla úspěšně izolována z fosilních kostí (např. z neandrtálce) nebo z hmyzu uchovaného v jantaru. Větší naději na úspěch lze očekávat v případě, že kost byla dlouhou dobu v chladném prostředí (například v permafrostu). Při takovýchto izolacích je však třeba postupovat velmi opatrně a pečlivě, neboť riziko kontaminace je veliké. Používají se speciální přetlakové místnosti v budovách, kde nejsou žádné další molekulární laboratoře a pracovníci používají speciální obleky připomínající skafandry, aby maximálně omezili kontaminaci vzorku svou vlastní DNA.
Postup izolace
Volba metody extrakce DNA závisí na tom, k čemu ji budeme dále používat. V některých případech vystačíme i s DNA horší kvality a v nízké koncentraci. V extrémním případě můžeme použít i jen zlyzované buňky. S kvalitně izolovanou DNA se nám však vždy bude pracovat lépe. Pro izolaci se používá celá řada různých protokolů a v poslední době se také často používají komerčně vyráběné soupravy (kity), které však bývají dražší. Ve většině případů však spolehlivě funguje klasická metoda založená na odstranění proteinů pomocí enzymu proteinázy K, extrakce směsí fenolu s chloroformem a precipitaci čistým lihem.
Snaha maximálně zjednodušit laboratorní protokoly vedla k řadě modifikací izolace DNA. Jednou z nich je nahrazení pufru s proteinázou roztokem obyčejného pracího prášku ve vodě (0,025g/ml). Tkáň se však v tomto případě musí v roztoku prášku dokonale homogenizovat. Při použití kvalitního extrakčního pufru s proteinázou K není tento krok nutný. Další modifikace se používá k izolaci DNA, určené pro její následující amplifikaci pomocí PCR (viz kap. „Polymerázová řetězová reakce“) – v tomto případě je extrakční pufr v zásadě shodný s pufrem používaným při této metodě (s tím, že i v tomto případě musíme přidat proteinázu).
Při izolaci tkání uchovávaných ve formalínu se v prvních krocích izolace někdy přidává DTT (až ve 100mM koncentraci) nebo se využívají speciální kity. Koncentraci izolované DNA určíme spektrofotometrem, nebo pomocí elektroforézy v málo koncentrovaném agarozovém gelu a srovnáním se standardy, které naneseme na gel společně se studovaným vzorkem. Izolovanou DNA před použitím obvykle zředíme vodou a zásobní koncentrovaný roztok uchováme v mrazničce. Zředěné vzorky, které používáme častěji, však můžeme poměrně dlouho uchovat i v lednici.