Mezibuněčný přenos DNA
Transformace
Transformace je spojena se stavem „kompetence“ buněk, která se dostavuje v určité růstové fázi. Právě v okamžiku kompetence je buňka schopna přijmout nukleovou kyselinu. Přijímaná nukleová kyselina musí mít určitou minimální délku, protože u kratších fragmentů nedojde po vstupu do buňky k integraci do genomu. Vychází se ze spontánní schopnosti buňky přijmout DNA. Stav kompetence je ovšem velmi krátký interval. Bylo prokázáno, že při spojení kultur ve stavu nekompetence, lze indukovat kompetenci u kultury, která je obvykle kompetentní později. Indukci lze provést i bezbuněčným filtrátem (předpokládá se uvolnění tzv. faktoru kompetence do prostředí kompetentní buňkou). Stav kompetence je spojen s komunikací molekuly DNA s buňkou - primárním kontaktem s receptory buňky. Vznikla otázka aktivace receptoru DNA a modifikace DNA po napojení. Receptorovým místem, glykoprotein, což je bílkovina podporovaná polysacharidovou složkou tak, že lze bílkovinou nebo sacharidovou složku modifikovat a aktivovat. Předpokládá se, že aktivační faktor je obsažen v genomu jako hydrolasa, která aktivní místo aktivuje.
Existuje ovšem i proces zhášení (deaktivace vazného místa), který je možná způsoben labilitou aktivačního faktoru a reversibilní změnou aktivního místa po jeho inaktivaci. Je zde i představa odkrytí pomocí odbourání části krytu, který se po rozpadu labilní hydrolasy znovu syntetizuje konstitutivními enzymy. Kdy a proč se aktivační faktor syntetizuje je zatím stále předmětem hypotéz.
Přenos DNA je u některých grammpozitivních organismů vázán na vývoj určité povrchové struktury (kompartmentu). Jedná se o částečné vyhřeznutí cytoplasmatické membrány, která tak není kryta buněčnou stěnou a má určité vazné místo pro DNA (které se ovšem opět musí aktivovat). Vývoj této struktury je ovšem jen prvním krokem a aktivace probíhá prakticky stejně jako v předchozím případě. Existují ovšem i studie, že samotný vývoj těchto struktur (anglicky nazývaných Blebs) zahrnuje i vytvoření aktivních míst.
První studie týkající se vstupu nukleové kyseliny do buňky se týkaly sudých T-fágů. Další studie předpokládají pasivní přenos pouze DNA a vytvoření poru v cytoplasmatické membráně speciální bílkovinou složkou, která přenos umožní. Dnes se předpokládají bodové kontakty cytoplasmatické membrány a buněčné stěny, které vedou k fragmentaci periplasmatického prostoru (Beyerovy můstky). V těchto místech může docházet k translokaci velkých molekul. Mezi můstky dochází k intenzivnímu obtékání těchto struktur materiálem periplasmatického prostoru (gel), což vede k otevření porů, které mohou obsahovat specifické proteinové struktury zajišťující kontakt s přenášenou molekulou.
Při transformaci i konjugaci dochází vždy k přenosu pouze jednoho vlákna do recipientní buňky. Druhý řetězec je buď odbouráván nebo zůstává vně buňky. V případě transformace musí buňka přijít do kontaktu pouze s jedním vláknem, aby došlo k integraci do genomu. Odbourání druhého vlákna se odehrává buď na vazných místech nebo volně v okolním prostoru. Štěpení probíhá velmi rychle a to až na úroveň jednotlivých nukleotidů. U konjugace není druhý řetězec degradován (zůstává v donorové buňce). Na řetězec vstupující do recipientní buňky se váží bílkovinné struktury, které jej stabilizují. Konjugace je determinována asi 30 geny, přičemž každý se značí Tra. Pro tyto proteiny se hledá lokalizace a funkce (vazná, enzymová, ATP-asová, struktury účastnící se vlastního spojení buněk). Na stabilizaci vstupujícího řetězce se podílí SSB-protein.
Obdobou procesu transformace je transfekce, kdy do buňky vstupuje nukleová kyselina izolovaná z viru.
Konjugace
Při konjugaci musí dojít k fyzickému kontaktu buněk, které musí mít určitou aktivitu - narozdíl od transformace zde nemůže být donor pasivní. Buňky obsahující konjugační faktor se označují F+ a procento vzniklých rekombinantů závisí na tom, jaké typy buněk se kříží. Největší množství rekombinantů vzniká při křížení F- buněk s tzv. Hfr buňkami, které mají konjugační F-faktor integrovaný do chromosomu. Konjugace v těchto případech jsou nejsledovanější. Skutečnost, že F-plasmid může být integrován do bakteriálního chromosomu z něho činí tzv. episom. V F-plasmidu je soustředěn veškerý genetický aparát konjugace.
Frekvence vzniku rekombinantů při konjugaci
křížení | počet rekombinantů |
F- x F- | 0 |
F+ x F+ | velmi nízký počet |
F+ x F- | 10-6 |
Hfr x F- | 10-2 |
Při vlastní konjugaci se jedna dlouhá fimbrie (sex-fimbrie) dotýká recipientní buňky. Dříve se předpokládalo, že nukleová kyselina může projít vnitřkem fimbrie, ale pravděpodobně se sex-fimbrie účastní jen v první fázi, kdy slouží k vyhledání partnera a participuje na přiblížení buněk (od svého základu se postupně odbourává). Do kontaktu se tak dostanou povrchy buněk. Tuto sex-fimbrii mohou tvořit pouze buňky vybavené F-faktorem a recipientní buňky mají na svém povrchu místo, kde se tato fimbrie zachytí. Buňky obsahující F-faktor mají vlastní vazebná místa zablokovány proteinem determinovaným právě F-faktorem (proto je velmi nízký počet rekombinací F+ x F+). Po přiblížení povrchů buněk se z F-faktoru začne jeden řetězec nukleové kyseliny odvíjet a přechází do recipientní buňky jako identická kopie F-plasmidu, čímž se z F- buňky stane F+. U buněk F+ lze F-faktor eliminovat prostředím s vysokým obsahem solí kobaltu, akridinových barviv nebo teplotními šoky.
Přenos genetické informace může být vnitrodruhový (např. mezi druhy r. Bacillus) nebo mezirodový (např. Bacillus (G+) ® Escherichia (G-)). Přenosy mezi taxonomicky bližšími rody jsou ovšem častější, rychlejší a úspěšnější.
U F-plasmidu není konjugace závislá na jaderném chromosomu (jak již bylo uvedeno, všechny informace o konjugaci nese F-plasmid sám). Konjugační plasmidy jsou ty, které jsou schopny realizovat přenos nukleové kyseliny. Je jich mnohem více než pouze F-plasmid a konjugaci determinují sami o sobě. Existují ovšem i plasmidy, které konjugaci sami nedeterminují, ale mohou otevřít řetězec a přejít do lineární formy a za pomoci plasmidu typu F mohou jedno vlákno přenést (přenos zajistí bílkoviny determinované F-plasmidem).
Základní děje konjugace:
1. dosažení kontaktu (zajišťuje sex-fimbrie) za účasti bílkoviného aparátu povrchových struktur.
2. vytvoření poru (mechanismus není znám) za účasti proteinů povrchových struktur (rozvolňují buněčnou stěnu a stabilizují por).
Por má vysokou stabilitu - přetrvává i po přenosu nukleové kyseliny a vzniklá donorová buňka může por po určitý čas využít k dalším transferům. Odvíjející se strand je okamžitě osazován bílkovinami MOD, které jej stabilizují a zakotvují v oblasti poru. Do recipientní buňky může také odvíjející se strand vstupovat jako smyčka. Proteiny MOD musí být lokalizovány vždy v přesném místě. U G+ buněk probíhá vstup nukleové kyseliny do buňky mechanismem valivé kružnice (rolling cyrcles), ale u G- buněk to probíhá pravděpodobně jinak.
Zatímco u transformací a transdukcí musí být nukleové kyseliny vždy téhož typu, konjugace může překročit mezidruhové bariery. Transformace zasahuje vždy stejný taxon a fágová infekce (transdukce) je již vysoce specifická. Při vniku nukleové kyseliny fágu do buňky může bakteriální chromosom (zpravidla jen pár jeho genů) vstoupit do genové informace fágu (zejména je-li nukleová kyselina fágu v klidové fázi integrována do bakteriálního chromozomu - nedokonalé odštěpení nukleové kyseliny fágu z chromosomu). F-faktor se do bakteiálního chromosomu zapojuje pokaždé na jiné místo (chromosom má pro něho více vazných míst) a po odpojení strandu F-faktoru pokračuje přenos genů chromosomu, které vstupují do recipientní buňky. Z hlediska napojení těchto genů za F-faktorem tak vstupují pokaždé jiné geny. Tímto způsobem lze vytvořit mapy bakteriálního chromosomu (pomocí času přenosu genů). Měří se doba za jak dlouho se např. geny pro syntézu argininu přenesou do recipientní kultury neschopné růst ne mediu bez argininu. Použije se k tomu kmen, který má F-faktor napojen poblíž.