Jdi na obsah Jdi na menu
 


Obory molekulární genetiky

31. 5. 2006

Buněčné inženýrství

Základní představou je spojení technologické buňky A s buňkou vhodných vlastností B v buňku AB, která je technologická a má žádané vlastnosti dodané buňkou B (vývoj hybridní buňky).

Smíchání obou buněčných obsahu ovšem vede k neshodě intracelulárních prostorů a ke ztrátě reprodukce. V podstatě se jedná o indukovanou fůzi protoplastů. Induktory jsou fůsogeny - polyethylenglykol o molekulové hmotnosti 1500 - 6000 o koncentraci 20 - 50% hmotn. v kombinaci s Ca2+. Předpokládá se, že tato látka ovlivňuje rozložení bílkovin v membráně - vlivem jejího působení se bílkoviny shlukují a odebírá se vodný obal. Vápenaté ionty mají funkci neutralizace náboje. Předpokládá se pouze účast fosfolipidové dvojvrstvy. Fůzovat lze i samotné kompartmenty nebo získat bezjaderné buňky (po oddělení pupenu), které lze také fůzovat - cytodukce. Pro znovunabytí reprodukční aktivity je nutná obnova buněčné stěny na kterou se soustředí veškerá buněčná aktivita. Pokud k obnovení dochází, je to první známka úspěšné fůze. Intracelulární prostředí se může lišit i vlivem rozdílné fáze růstového cyklu - u stejného druhu. Úspěšnější je proto fůzovat buňky v synchronizované kultuře. Navíc odstranění buněčné stěny je značně nefyziologické. K obnově buněčné stěny se používají velmi řídké agary. Pokud dojde ke spojení genetického materiálu, dochází ke značnému počtu rekombinací.

 Genové inženýrství

Každá buňka je vybavena univerzálním restrikčně modifikačním systémem, což je schopnost rozlišit vlastní nukleovou kyselinu od cizorodé, která je likvidována (pomocí restrikčních endonukleas). Rozpoznání může být založeno např. na tom, že vlastní nukleová kyselina je modifikována na specifických místech (např. metylací na adeninu nebo cytosinu). Restrikční endonukleasy lze použít ke štěpení nukleových kyselin a získání jejich fragmentů. Genové inženýrství tak přenáší jen vybranou část genetické informace (narozdíl od buněčného).

Při štěpení mohou vzniknout hladké nebo kohezní konce, které jsou vhodnější pro spojení fragmentu s nukleovou kyselinou do které se vkládá (vektoru). Vektorovou molekulu může tvořit plasmid, který se otevře pomocí endonukleas a prostřednictvím DNA-ligasy (existuje jich několik) se spojí s vybraným fragmentem a znovu uzavře. Získá se tak vektor (plasmid) s vybraným fragmentem nukleové kyseliny, který se nazývá rekombinovaná DNA (rDNA), případně chimera. Důležité je, aby se plasmid v recipientní buňce udržel, zachoval si reprodukci (musí být stabilní v potomstvu) a vyjádřil příslušný vložený gen.

Celkový postup lze tedy shrnout do těchto kroků:

1.    separace a příprava fragmentu DNA, kterým má být obohacen genofond recipienta. Používají se k tomu restrikční endonukleasy, chemické syntézy, případně reversní transkriptasa (působící na templát RNA).

2.    volba a příprava nosiče (vektoru) nové genetické informace. Většinou se používají plazmidy z recipientní buňky. Důležité je sledovat, jaké místo zasáhne restrikční endonukleasa při štěpení - nesmí to být replikační gen plasmidu nebo jiný užitečný gen!!! Je-li v plasmidu např. infomace o resistenci k některému antibiotiku, potom lze podle získané resistence recipientní buňky usoudit, že tam plasmid vstoupil. Důležité je spolu s přenášenou vlastností přenášet i regulační oblast. Regulační oblasti i plasmidy jsou v současné době komerčně dostupné. Nejčastější regulační oblastí je lac-operon - vložená informace se potom vyjádří po indukci laktosou (ať je to cokoliv). Lze použít několik fragmentů najednou a náseldně isolovat buňky s příslušnou vlastností (model Shot Gun) nebo použít přesně definovaný fragment (model kulovnice Rifle). Při molekulárním klonování se použije plazmid s velkou replikační schopností a mnohokrát se zkopíruje.

3.    integrace fragmentu do nosiče - příprava rekombinované DNA

4.    volba příjemce rekombinované DNA

5.    přenos rekombinované DNA do recipientní buňky. Přenos lze provést zabalením chimery do liposomu a následnou fůzí protoplastů, případně transformací nebo elektroporací.

6.    selekce jedinců s hybridní genetickou informací, popř. jejich namnožení a další izolace.

Restrikční endonukleasy jsou popsány např. následujícím způsobem: Eco (Escherichia coli), počet míst kde štěpí nukleovou kyselinu fágu l.

Teorie geneticky modifikovaných organismů (GMO) - předpisy a nařízení

Genově modifikovaný organismus se nesmí šířit (např. nekontrolovatelným únikem) přes určitou barieru (hranici). Každý kdo pracuje s GMO má povinnost tuto barieru vytvářet a kontrolovat její neprůchodnost. Biologickou barierou může být např. vytváření fenotypů (např. UV-záření) v kterém daný mikroorganismus nepřežije.

Další povinností pracovníků s GMO je vypracovat analýzu rizik a předložit dokumentaci genově modifikovaného organismu. Většina GMO není vytvářena uživateli a od výrobců GMO musíme získat potřebné informace. Pozor! - výrobce není povinnen poskytovat informace automaticky (musí je ovšem poskytnout na vyžádání).

První podmínkou pro schválení provozu je nepracovat s organismem patogenním nebo podmíněně patogenním (to se týká jak dárce tak příjemce genové informace) - lze to zjistit přes taxony původních druhů.

Musí se zjistit, jakou cestou byla genetická informace převedena. Klíčová je informace o vektoru (plazmid, jiný aparát ...). Plasmid nesmí nést genetickou informaci spojenou s patogenitou nebo jinou nepříjemnou vlastností (např. resistencí vůči antibiotikům). Je bezpodmínečně nutné vědět, co přesně daný plasmid přenáší a zda nenese kompletní informaci pro konjugaci či zda nemůže být přenášen spontánně (potom by se mohl rychle šířit!).

Virologie

Virová částice - virion - je charakterizována především svým tvarem (sférický, mnohostěnný). Mnohostěny se staví absolutně přesně a symetricky. Každý virion nese nukleovou kyselinu, která bývá většinou uložena ve zvláštním kompartmentu podobném jádru eukaryot (značí se „core“ - jádro). Obal je primitivní, podobný membráně, ale bývá složen z bílkovin (z lipidů málokdy). Vnější obal je obdobný, ale vykazuje větší variabilitu, obsahuje lipidy a má na sobě části membrán hostitelských buněk.

Lytický cyklus sestává z těchto částí:

-     kontakt s hostitelskou buňkou

-     průnik virové nukleové kyseliny

-     osud této nukleové kyseliny v intracelulárním prostoru a produkce nových virových částic (10 - 100)

-     zánik hostitelské buňky (ve většině případů)

-     uvolnění virových částic a šíření infekce

Nukleová kyselina některých virů nese gen, který je v přímé souvislosti s lysí buňky. Uvolňování virionů může ale probíhat i exocytosou.

Virové částice se počítají na základě střetu s citlivou bakterií. Na Petriho misce se vytvoří souvislý nárůst, který se přelije suspenzí virových částic a po určité době se počítají místa (plaky), kde došlo k infekci. Tomuto počtu se ve virologii říká titr. Dalšími pojmy jsou: input - minimální počet virových částic připadajících na jednu buňku, aby došlo k úspěšné lysi; burst size - počet částic uvolněných při lyzi jedné buňky.

HIV1, HIV2

Patří do skupiny retrovirů, které jsou známy již dlouhou dobu a od 60.tých let byly intenzivně zkoumány a velice dobře poznány.

 Virus HIV

V bílkoviné kapsidě se nachází dvě molekuly RNA, spolu s reversní transkriptasou. Vnější obal tvoří proteiny kodované virovou RNA a proteiny hostitelské buňky (uvolnění probíhá specifickým procesem pučení). Vnější bílkovinný obal se na třech místech dotýká kapsidy (kontakt je způsoben kyselinou meristovou).

Zásadní odlišností virů HIV od běžných retrovirů je přítomnost zvláštního glykoproteinu (GP120) na povrchu složeného ze složek TM (integrální část ponořená v bílkoviném obalu) a SU (povrchová část). Tento glykoprotein má receptorový protějšek CD4, kterým je vybavena terčová buňka - T4-lymfocyt, makrofág, monocyt.

Reversní transkriptasa přítomná v jádře je aktivní a okamžitě k dispozici. HIV patří do relativně velké skupiny virů, které se mohou rozhodnout zda lytický cyklus dokončí nebo dočasně přeruší. Reprodukovaná virová DNA se tak může reprodukovat dále za vzniku virionů nebo se může integrovat do chromosomu a navodit tak stav lysogenie.

V případě integrace do chromosomu nedojde k ovlivnění DNA hostitele. Včlenění provádí integrasa podobná topoisomerasam (ligační cesta). Ve stavu lisogenie dochází k autorepresi celého bloku genů viru pomocí represoru, který je virem taktéž definován.

Uvolnění virové DNA a rozběhnutí lytického cyklu nastává spontánně - např. změnou podmínek - teplotní šoky, deficience na určitou látku apod. Je ovšem otázkou, co startuje lytický cyklus v případě lysogenie T4-lymfocytu. Při přítomnosti antigenu podléhá T4-lymfocyt diferenciaci a získává svoji charakteristiku. V tomto stavu přijímá signály pro konverzi na účinnou buňku, která se zapojí do imunitního systému. Indukce lytického cyklu HIV je v tomto případě spojena s některým diferenciačním krokem T4-lymfocytu, který je startován určitým signálem imunitního systému.

Vlastní T4-lymfocyt po nastartování lytického cyklu nezaniká, ale není zcela odolný k lytickým cyklům a po nahromadění viru způsobí selhání imunitního systému.

Priony

Jedná se o subvirové částice povahy proteinů známé zejména jako původci Creutsfeld-Jackobovy nemoci - degenerativní vývoj mozkové tkáně (ztráty paměti ® demence ® smrt = 2 roky). Tato nemoc se vyskytuje u kanibalských kmenů kuru, kde onemocnění přichází po konzumaci nakažené mozkové tkáně. Při pokusech byl homogenát tkáně integrován do mozku šimpanze a také došlo k nakažení. Dalšími onemocněními, za které jsou zodpovědné priony jsou onemocnění ovcí - scarpie (odírání kůže o skály) a nemoc šílených krav.

V napadených tkáních nervových buněk se nachází hydrofobní bílkovina isoprion. Ve zdravých tkáních se nachází velké množství prionů, které mohou provádět různé konformační změny. Priony velmi rychle agregují a váží na sebe hydrofobní molekuly. Působením isoprionů pravděpodobně dojde ke změně konformace prionů a vzniku onemocnění.

 

Komentáře

Přidat komentář

Přehled komentářů

Zatím nebyl vložen žádný komentář