Články a informace z různých oblastí lékařství

Elektroforéza je analytická metoda založená na rozdílné pohyblivosti částic látky v elektrickém poli, která závisí na velikosti náboje, velikosti molekul, jakož i na vlastnostech prostředí.

Zónová elektroforéza

Jde o nejrozšířenější elektroforetickou metodu. Využívá jako nosiče acetylcelulózu, nebo různé gely (agarový, agarózový nebo polyakrylamidový). Pro kvalitu separace jsou rozhodující:

·        homogenita a velikost elektrického pole

·        homogenita a velikost pórů nosiče a jeho fyzikálně-chemické vlastnosti

·        pH pufru, jeho iontová síla a případné interakce se vzorkem.

Při dělení na acetylcelulózových fóliích dochází k distribuci převážně podle velikosti náboje. K dělení se v elektroforetické vaně používá napětí 10 - 30 V/cm, intenzita proudu do 0,3 až 0,5 mA/cm a elektroforéza trvá 15 - 30 minut. Po ukončení dělení se jednotlivé složky fixují a barví. Pak se fólie odbarví, příp. zprůsvitní a vysuší. Při práci s agarem (směs polysacharidů agarózy a agaropektinu) anebo s purifikovanou agarózou se postupuje podobně. Použití agaru má relativní nevýhodu v tom, že jeho vlákna obsahují řadu fixních disociovatelných skupin, které za alkalického pH nesou negatívní náboj. To se projevuje elektroendoosmózou, tedy tokem pufru směrem ke katodě, tj. proti směru dělení např. většiny sérových bílkovin. To může při elektroforéze dokonce vyvolat zpětný pohyb některých frakcí, takže místo k anodě se "pohybují" ke katodě.

Při elektroforéze na polyakrylamidovém gelu (PAGE) se látky dělí nejen na základě elektrického náboje, ale i podle velikosti molekul. Efekt molekulového síta se zesílí v polyakrylamidovém gelu s gradientem hustoty. V tomto uspořádání se ve směru pohybu dělených látek zvyšuje koncentrace akrylamidu, a tím se zmenšuje při polymeraci velikost ok sítě. V místech zastavení pohybufrakce se vytvoří linie, aprotose tento typ elektroforézy nazývá disková. Rozlišovací schopnost tohoto typu elektroforézy je mnohem vyšší než u předchozích nosičů. Jestliže se k polyakrylamidovému gelu přidá laurylsíran sodný (dodecylsulfát sodný, SDS), mají všechny molekuly téměř stejný elektrický náboj a dělí se jen podle velikosti svých molekul.

Vyhodnocení obarvených elektroforeogramů se provádí na densitometru tak, že se elektroforeogram automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky (z žárovky s halogenovou atmosférou, světlo emitující diody nebo výjimečně i laseru). V místě frakcí dochází k částečné absorpci záření. To se projeví při jeho dopadu na čidlo (fotonku, fotonásobič) a převodu signálu na analogový záznam elektroforeogramu. Po zpracování integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých elektroforetických frakcí. Tento způsob je častý při rutinních elektroforézách sérových bílkovin, kdy na jedné podložce může být současně i několik desítek elektroforeogramů. Po ukončení snímání prvního elektroforeogramu se měřená deska automaticky posune a může se vyhodnocovat další dráha.

Izoelektrická fokusace

Od předchozích technik se izoelektrická fokusace liší tím, že dělení probíhá v gradientu pH, který se mění rovnoměrně od kyselé do alkalické oblasti (u anody je pH nejnižší a směrem ke katodě roste). Gradientu se dosahuje pomocí amfolytů, tj. elektrolytů, obsahujících směsi organických látek se skupinami -NH₂ a -COOH), které se ve stejnosměrném elektrickém poli seřadí podle velikosti svého izoelektrického bodu (pI) a vytvoří tak gradient pH. Izoelektrický bod je hodnota pH, při níž je pro danou látku vyvážen počet kladných a záporných nábojů, takže se molekula jeví navenek jako elektroneutrální.

Při izoelektrické fokusaci je nosičem agarózový nebo polyakrylamidový gel. Metoda se používá zejména pro dělení izoenzymů. Předností je vysoká ostrost dělení (rozlišovací schopnost), nevýhodou je pak vyšší cena amfolytových pufrů a zdlouhavost metody.

Izotachoforéza

Je to analytická metoda pro dělení kationtů a aniontů ve stejnosměrném elektrickém poli podle jejich rozdílných pohyblivostí. U izotachoforézy je vzorek umístěn mezi dva různé elektrolyty s odlišnou pohyblivostí iontů. Na čele se pohybuje vedoucí elektrolyt, který musí mít větší pohyblivost než kterýkoliv z kationtů resp. aniontů (podle typu izotachoforézy) obsažených ve vzorku. Na konci kapiláry je koncový elektrolyt, který má menší pohyblivost než kterýkoliv z kationtů resp. aniontů (podle typu izotachoforézy) obsažených ve vzorku. Všechny ionty se pak kapilárou pohybují stejnou rychlostí k opačně nabitým elektrodám, avšak budou seřazeny podle svých pohyblivostí. Po určité době jednotlivé složky vytvářejí ostře oddělené zóny seřazené těsně za sebou. To, že se pomalejší ionty pohybují stejně rychle jako ionty pohyblivější je možné díky tomu, že v každé zóně je jiný gradient potenciálu, který je nepřímo úměrný vodivosti roztoku v zóně. Na konci kapiláry je umístěné čidlo detektoru, které měří vodivost nebo absorpci UV světla dané vrstvy. Naměřený signál se pak převede na analogový zapisovač a může být vyjádřen také v číselné formě. Při izotachoforéze pracujeme s vysokým napětím (až 35 kV).

Předností izotachoforézy je rychlost provedení (někdy postačují 4 minuty) a ostrost dělení. Tímto způsobem lze stanovit několik aniontů (nebo kationtů) současně. V klinické biochemii se tímto způsobem stanovují hlavně anionty (laktát, pyruvát, ketokyseliny aj.)

Kapilární elektroforéza

Provádí se v tenkých skleněných kapilárách (světlost 0,1 mm) dlouhých až 1 m, které mohou být plněny polyakrylamidovým gelem (PAA) nebo analytickým pufrem. Při práci s PAA je princip dělení stejný jako u zónové elektroforézy. V případě použití analytického pufru se obvykle používá fosfátový pufr a vyšší napětí. Detekce frakce se na rozdíl od zónové elektroforézy provádí UV absorpčním detektorem nebo detektorem diodového pole.

Kapilární elektroforéza je rychlá, má vysokou rozlišovací schopnost a nízkou spotřebu vzorku. Stupeň automatizace je značný, součástí zařízení může být automatické dávkování, několikanásobný nástřik, výměna nebo doplnění pufru, změna polarity, program napětí a tlaku a sběr frakcí. V klinické biochemii se kapilární elektroforéza používá dosud omezeně, hlavně při diagnostice metabolických poruch a subfrakcí imunoglobulinů.